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细胞的冻存与复苏


运行平台:/WinXP软件评级:
文件大小:软件语言:简体中文
软件授权:免费软件演示地址:暂无演示
下载次数:5053 次发布时间:2009-08-17 14:22:05

软件简介:

一、概述

目前,细胞冻存最常用的技术是液氮冷冻保存法,主要采用加适量保护剂的缓慢冷冻法冻存细胞。细胞在不加任何保护剂的情况下直接冷冻,细胞内外的水分会很快形成冰晶,从而引起一系列不良反应。如细胞脱水使局部电解质浓度增高,pH值改变,部分蛋白质由于上述原因而变性,引起细胞内部空间结构紊乱,溶酶体膜由此遭到损伤而释放出溶酶体酶,使细胞内结构成分造成破坏,线粒体肿胀,功能丢失,并造成能量代谢障碍。胞膜上的类脂蛋白复合体也易破坏引起细胞膜通透性的改变,使细胞内容物丢失。如果细胞内冰晶形成较多,随冷冻温度的降低,冰晶体积膨胀造成细胞核DNA空间构型发生不可逆的损伤,而致细胞死亡。因此,细胞冷冻技术的关键是尽可能地减少细胞内水分,减少细胞内冰晶的形成。采用甘油或二甲基亚砜作保护剂,这两种物质分子量小,溶解度大,易穿透细胞,可以使冰点下降,提高细胞膜对水的通透性,且对细胞无明显毒性。慢速冷冻方法又可使细胞内的水分渗出细胞外,减少胞内形成冰结晶的机会,从而减少冰晶对细胞的损伤。

二、主要冷冻设备和材料

常用的细胞冷冻贮存器为液氮贮存器,规格有 35L3和50L3两种。使用时要注意以下几点:

(1)一般两周需充液氮一次,至少一个月充氮一次。液氮温度达-196℃,使用时注意勿让液氮溅到皮肤上,以免引起冻伤。

(2)液氮容器为双层结构,中间为真空层,瓶口有双层焊接处,应防止焊接部裂开。

(3)在装入液氮时,要注意缓慢小心,并用厚纸卷筒或特制漏斗作引导,使液氮直达瓶底,如有专用液氮灌注装置则更好。若为初次使用,加液氮时更要缓慢,以免温度骤降而使容器损坏。

细胞冻存时常备的材料有:0.25%胰蛋白酶,含10%~20%的血清培养液,DMSO(分析纯)或无色新鲜甘油(121°C蒸气高压消毒),2mL安瓿(或专用细胞冻存管)、吸管、离心管、喷灯、纱布袋(或冻存管架)等。

三、细胞冻存方法

主要操作步骤为:

(1)选择处于对数生长期的细胞,在冻存前一天最好换液。将多个培养瓶中的细胞培养液去掉,用0.25% 胰蛋白酶消化。适时去掉胰蛋白酶,加入少量新培养液。用吸管吸取培养液反复吹打瓶壁上的细胞,使其成为均匀分散的细胞悬液。悬浮生产细胞则不要消化处理。然后将细胞收集于离心管中离心(1000r/min,10分钟)。

(2)去上清液,加入含20%小牛血清的完全培养基,于4℃预冷15分钟后,逐滴加入已无菌的DMSO或甘油,用吸管轻轻吹打使细胞均匀,细胞浓度为3×106~1×107/mL之间。

(3)将上述细胞分装于安瓿或专用冷冻塑料管中,安瓿装1~1.5mL在火焰喷灯上封口,封口处要完全封闭,圆滑无勾。冷冻管要将盖子盖紧,并标记好细胞名称和冻存日期,同时作好登记(日期、细胞种类及代次、冻存支数)。

(4)将装好细胞的安瓿或冻存管装入沙布袋内;置于液氮容器颈口处存放过夜,次日转入液氮中。采用控制降温速度的方法也可采用下列步骤:先将安瓿置入4℃冰箱中2~3小时,再移至冰箱冷冻室内3~4小时(此步可省略),再吊入液氮容器颈气态部分存放2小时,最后沉入液氮中。

细胞冻存在液氮中可以长期保存,但为妥善起见,冻存半年后,最好取出一只安瓿细胞复苏培养,观察生长情况,然后再继续冻存。

四、细胞株的复苏

复苏时,从液氮中取出冻存管,立即置37℃水浴中融化细胞。将细胞直接加入 10ml含15%小牛血清的RPMI-1640培养液中,置37℃ 5%CO2饱和水汽二氧化碳培养箱中培养。悬浮细胞待细胞全部沉降后小心吸去上清液,更换新鲜的上述培养液,继续培养;帖壁细胞则培养2~3小时 ,贴壁细胞弃培养液后用PBS洗两遍,胰酶消化(具体时间要看细胞类型了),弃去胰酶后加培养液,吹打下细胞以后,收集在离心管里,800转 5分钟,倒掉离心管理的培养液,加一毫升冻存液吹匀,加到冻存管里,4摄氏度半小时,-20℃1.5个小时,-80℃可以保存两个月。

 


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